PREFAZIONE
La distruzione dei radicali liberi superossido e dei metaboliti che si vanno accumulando nei tessuti colpiti dalla psoriasi è alla base di ogni intervento teso a ripristinare le normali funzioni fisiologiche del tessuto epidermico. I radicali liberi sono tra i principali responsabili dei meccanismi ossidativi nella cellula.
Per RADICALE LIBERO si intende una specie chimica capace di esistenza indipendente, che contiene uno o più elettroni spaiati e, pertanto altamente reattiva nei confronti di altre molecole. Molto dannosi sono il radicale idrossilico e il radicale perossido i quali, secondo una teoria proposta da Harman nel 1954, causerebbero un danno alle membrane, un'alterazione delle proteine, un'inattivazione degli enzimi e una produzione di pigmento senile. L'azione citotossica dei radicali liberi viene contrastata da sistemi di difesa cellulari rappresentati da enzimi che si comportano da ANTIOSSIDANTI:
SOD (superossido dismutasi) che combatte l'azione dei radicali convertendoli in (acqua ossigenata), CATALASI e GLUTATIONE PEROSSIDASI che convertono l' in acqua pura prima che altri complessi la usino come substrato per generare radicali . I radicali liberi vengono generati sia durante le normali reazioni metaboliche che avvengono nella cellula , sia per induzione da agenti esterni come farmaci, sostanze alimentari, pesticidi, fumo di tabacco, radiazioni ultraviolette. La fotoesposizione incontrollata è uno dei più importanti fattori responsabili del processo generale dell' invecchiamento cutaneo generando nel corso degli anni atrofia dell'epidermide, alterazioni della pigmentazione, rughe, secchezza e, talvolta formazioni di placche.
Numerosi esperimenti hanno dimostrato che la vita media di colture cellulari umane diploidi sottoposte a stress, sostanze tossiche e raggi UV viene aumentata dall'aggiunta di sostanze antiossidanti nel terreno di crescita suggerendo così a dermatologi e cosmetologi di salvaguardare la nostra pelle dall'insidia dei radicali liberi integrando i prodotti cosmetici impiegati giornalmente per la cura personale con un ingrediente antiossidante. Citiamo a questo proposito le Vitamine A, C ed E che sono tra i più potenti agenti che proteggono le cellule dalla perossidazione lipidica. La vitamina C, in particolare, se somministrata ad alte concentrazioni, è capace di intereagire molto rapidamente sia con i superossidi che con i radicali idrossilici, è facilmente reperibile dall'estrazione da frutta e ortaggi, non è tossica nemmeno se assunta a dosi elevate, attiva tutti i nostri processi vitali, protegge le membrane cellulari, aumenta la resistenza della pelle nei confronti degli agenti esterni dannosi ,interviene negli scambi cellulari favorendo l'assorbimento delle sostanze nutrienti, ritarda il processo di invecchiamento cellulare. La capacità di stimolare in vitro la crescita del cheratinocita , e di non interferire con il suo metabolismo con effetti citotossici anche a concentrazioni piuttosto elevate, può essere ritenuto un indice della elevata dermocompatibilità del prodotto e anche del suo potenziale ruolo nell'accelerare il turn-over della cute.

SCOPO
Scopo del test è valutare se il prodotto in questione, a diverse percentuali di diluizione, possieda in vitro una capacità antiossidante andando a determinare la sua capacità di neutralizzare le specie reattive dell'ossigeno (ROS, o radicali liberi) e di inibire il danno da ossidazione alle membrane cellulari, ripristinando le normali funzioni fisiologiche del tessuto epidermico. Inoltre si intende verificare la tollerabilità del prodotto per il cheratinocita nonché la sua dermocompatibilità.

Informazioni legali
La valutazione dell'eventuale potere antiossidante, è un valido aiuto per verificare l'esistenza di attività antiradicalica vantata dal prodotto sottoposto a test come richiesto dalla VI modifica della direttiva CEE 76/768

FLAVOREX
Protocollo n°/ Record no. 2001X003A
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VALUTAZIONE IN VITRO DELLA FUNZIONALITA' ANTI-RADICALICA DI "FLAVOREX" ATTRAVERSO LO STUDIO DELL'AZIONE ANTIOSSIDANTE E PROTETTIVA IN COLTURE CELLULARI DI CHERATINOCITI UMANI.

Il cheratinocita è il principale tipo cellulare che compone l'epidermide e partecipa attivamente a tutti gli aspetti funzionali che la caratterizzano. I cheratinociti utilizzati negli esperimenti in vitro qui condotti sono di tipo primario, cioè provengono da una biopsia di cute sana di un donatore
Per approfondire il ruolo antiossidante giocato dalle sostanze testate, si è deciso di ricorrere a quattro diversi tipi di test.
Il primo test consente di valutare se i prodotti possiedano attività di neutralizzazione nei confronti delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) mediante la misura in vitro della quantità di ROS prodotti dalle cellule dopo uno stress ossidativo indotto, in presenza o meno della sostanza indagata e di opportuni controlli.
Il secondo test , attraverso la quantificazione dell'enzima lattatodeidrogenasi (LDH), consente di quantificare il verificarsi di danni alle membrane cellulari, e quindi anche alle componenti lipidiche di queste, in seguito ad esposizione allo stress ossidativo, in presenza o meno della sostanza indagata e di opportuni controlli.
Il terzo test, attraverso la determinazione della vitalità delle cellule tramite la metodica MTT, consente di valutare il danno totale subito dalle cellule in seguito allo stress ossidativo e l'effetto protettivo esercitato dalle sostanze indagate a diversa concentrazione.
Il quarto test infine, sempre attraverso la determinazione della vitalità delle cellule tramite la metodica MTT, dopo esposizione a diverse concentrazioni della sostanza da testare e rispetto a cellule non trattate, consente di evidenziare la dose soglia di tollerabilità per le cellule della sostanza in esame e la dose eventualmente in grado di stimolare la crescita cellulare.

Dosaggio dell'LDH
La lattato deidrogenasi è un enzima intracellulare, che normalmente non è rintracciabile nel terreno di coltura delle cellule. Quando si verifica un danno alle membrane cellulari, per esempio in seguito ad esposizione ad uno stress ossidativo che danneggia la componente lipidica di cui è ricca la membrana, fattori intracellulari possono diffondere nel mezzo di coltura (supernatante), incluso l'LDH. La sua presenza nel medium di coltura è quindi indicativa di un danno di membrana ed è quantitativamente correlata all'entità del danno occorso. Questo modello cellulare viene quindi utilizato come schema sperimentale per valutare la capacità da parte delle sostanze testate di proteggere i lipidi di membrana dallo stress ossidativo. La determinazione quantitativa dell'LDH viene effettuata con un kit commerciale analizzando i supernatanti dopo 1,30 h ore di esposizione a perossido d'idrogeno 500 micromolare, in presenza o meno delle sostanze indagate a diverse concentrazioni e dei controlli. Il metodo si basa sulla capacità del terreno di trasformare il piruvato in lattato in presenza del sistema NADH, H+/NAD+. La misurazione viene fatta spetrrofotometricamente a 340 nm.

Misura della vitalità cellulare tramite MTT
Le cellule in coltura sono trattate con lo stress ossidativo e con diverse concentrazioni delle sostanze da testare. Dopo alcune ore viene valutata tramite il test MTT l'impatto tossico sul sistema energetico cellulare (mitocondri)rispetto a cellule non protette dallo stress ossidativo e a cellule non esposte a stress.
The cell cultures are treated with the oxidative stress and with many concentrations of the test compounds for a number of hours. At the end of the exposure period a MTT assay is performed to measure the toxic impact on the cellular energy system (mitochondria) respect to not treated and not protected cells.

Il test MTT è semplice, accurato e dà risultati riproducibili. Questo metodo, sviluppato originariamente da Mossman (1993) , si basa sul bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio ( MTT), sostanza di colore giallo in soluzione. La deidrogenasi mitocondriale delle cellule vive è in grado di tagliare l'anello tetrazolico causando la formazione di sali violacei insolubili in soluzione acquosa. I cristalli possono essere disciolti in isopropanolo acidificato e la soluzione viola che si forma può essere dosata spettrofotometricamente. Un aumento/diminuzione nel numero delle cellule vitali può essere valutato come corrispondente incremento o decremento dell'assorbanza ottica dovuta ai sali di formazano, dando una quantificazione dell'evento citotossico globale.

Riepilogo dei dati rilevati e valutazione dell'eventuale capacità antiossidante dei prodotti sottoposti alla sperimentazione

il campione contraddistinto dalla sigla :
FLAVOREX
possiede attività antiossidante e stimolante correlata
al processo antiradicalico.

IL PRODOTTO RIDUCE IN MODO SIGNIFICATIVO LA PERCENTUALE DI ROS PRESENTE IN CHERATINOCITI UMANI SOTTOPOSTI IN VITRO A STRESS OSSIDATIVO.

IL PRODOTTO RIDUCE IN MODO SIGNIFICATIVO LA PERCENTUALE DI LDH PRESENTE IN UN TERRENO DI COLTURA DI CHERATINOCITI UMANI SOTTOPOSTA A STRESS OSSIDATIVO.

IL PRODOTTO NON ESERCITA EFFETTI CITOTOSSICI NE' POSSIEDE POTENZIALE IRRITANTE ALLE CONCENTRAZIONI TESTATE (COMPRESA TRA 0,1 MG/ML E 0,01 MG/ML) FAVORENDO LA CRESCITA DEI CHERATINOCITI IN VITRO.

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